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人血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)ELISA試劑盒實驗使用說明書
BS-9809人血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)ELISA試劑盒
一、產(chǎn)品概述
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，專用于檢測人血清、血漿、組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清等樣本中的VEGF-A濃度。僅供科研使用。
二、試劑盒組成
預包被微孔板?：12孔×8條(96孔規(guī)格)或12孔×4條(48孔規(guī)格)，預包被抗VEGF-A捕獲抗體。
標準品?：凍干粉，需用標準品稀釋液復溶后倍比稀釋(建議濃度梯度：10、3.33、1.11、0.37、0.12、0.04、0 ng/mL)。
檢測抗體-HRP?：辣根過氧化物酶標記的抗VEGF-A抗體。
洗滌緩沖液?：20×濃縮液，需用蒸餾水按1:20稀釋。
底物溶液?：TMB顯色液A/B，使用前1:1混合，15分鐘內(nèi)用完。
終止液?：2M溶液。
樣本稀釋液?：用于稀釋高濃度樣本。
封板膜?：2張，用于溫育時密封微孔板。
三、實驗原理
VEGF-A與預包被捕獲抗體結(jié)合，形成“抗體-抗原"復合物;加入HRP標記檢測抗體后，形成“夾心結(jié)構(gòu)"。經(jīng)洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)，加入TMB底物顯色(藍色)，終止液終止反應后變黃色。450nm波長測定吸光度(OD值)，濃度與OD值呈正比。
四、實驗步驟
樣本準備?
血清/血漿：離心去除顆粒物，避免溶血;2-8℃保存≤48小時，長期保存需-20℃/-80℃(避免反復凍融)。
細胞上清：離心取上清，避免含高濃度蛋白酶劑。
試劑準備?
洗滌液：濃縮洗滌液室溫結(jié)晶時，40℃水浴溶解后按1:20稀釋。
標準品：復溶后倍比稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。
底物：TMB A/B液1:1混合，避光保存。
操作流程?
加樣?：每孔加入100μL標準品/樣本，37℃孵育90分鐘。
洗滌?：甩干孔內(nèi)液體，用洗滌液浸泡1分鐘/次，重復3次。
加檢測抗體?：每孔加入100μL HRP標記抗體，37℃孵育60分鐘。
洗滌?：同步驟2。
顯色?：每孔加入90μL TMB底物，37℃避光孵育15-20分鐘。
終止?：每孔加入100μL終止液，混勻后30分鐘內(nèi)測定OD值。
結(jié)果計算?
以標準品濃度(ng/mL)為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線。
根據(jù)樣本OD值代入曲線計算濃度，乘以稀釋倍數(shù)得結(jié)果。
五、注意事項
試劑保存?：未使用試劑盒需2-8℃避光保存，有效期6個月;復溶標準品可分裝凍存，避免反復凍融。
樣本處理?：避免使用含的樣本，防止HRP活性。
操作規(guī)范?：移液需，避免氣泡;洗滌需，防止交叉污染。
安全防護?：終止液含強酸，需戴手套操作。
六、預期結(jié)果
靈敏度?：≤1.54 pg/mL(實際以說明書為準)。
檢測范圍?：典型范圍為3.12-200 pg/mL，部分試劑盒擴展至62.5-2000 pg/mL。
重復性?：板內(nèi)/板間變異系數(shù)分別<10%和<15%。
七、常見問題解答
Q?：顯色過淺或過深?
A?：調(diào)整樣本稀釋倍數(shù)或孵育時間;確保底物新鮮配制。
Q?：標準曲線線性差?
A?：檢查復溶操作，避免氣泡;更換移液器吸頭。
注：以上僅供參考，本產(chǎn)品僅供科研使用，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。
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